各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单↘细胞原核生物特性，这种差异就表现得更加明显。不同细菌具有不同的酶系统，故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同，利用这种特点建立细菌生化反应，在菌株的分类鉴定中具有主要意义。
【实验目的】
1. 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理。
2. 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法。
【实验原理】
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以♂利用相同的底物，却产〗生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。
【试◤剂与器材】
1. 菌种 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌↓(Enterobacter aerogenes)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌♂种
2. 培养基 葡萄糖蛋白胨『水培养基、蛋白胨水培养基、糖】发酵培养基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)
3. 试剂 40%NaOH溶液、肌酸、甲基红试□剂、吲哚试剂、8、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
4. 器具 超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜Ψ 氏小套管。
5. 流程 糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验。
【实验方◤法与步骤】
1. 糖︽发酵实验
① 试管标记 取分别装有不同糖类(如葡萄糖、蔗糖和乳糖等)发酵培养液的试管，根据需要培】养的细菌做好标记(如大肠埃希菌、产气肠杆菌、普通变形菌等和空白对照「)。
② 接种培养 以无菌操作分别接种少【量菌苔至以上各相应试管中，空白对照中不接种，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h和72h观察结果。
③ 观察记录 培养后各发酵管与空白对照相比，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果←为阴性，表明该菌◤不能利用该种糖，记录用“-”表示;如培养液呈黄色ぷ，反应结果为阳性①，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“+”表示;如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“-”表示。
2. V.P.试验
① 标记试管 取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，根据需要将培养的细菌做好标记。
② 接种培养 以无菌操作分∩别接种少量菌苔至以上相应试管中∑ ，空白对照管不接种，置37℃恒温箱中，培养24～48h。
③ 观察记录 取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40%NaOH溶液10～20滴，并加入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温〒箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性⌒ 反应(用“+”表示);若不↑呈红色，记录为V.P.试验阴性反应(用“-”表示)。
注：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。
3. 甲基红试验(M.R.试验)
取装有葡萄糖蛋白胨水培养液的试管，接种需培养鉴□ 定的细菌，经过■夜培养后，加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁△加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应;若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“+”或“-”表示。
4. 吲哚试验
① 试管标记 取装有蛋白胨水培养液的∩试管，根据需要●培养的细菌做好标记。
② 接种培养 以无菌操〗作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。
③ 观察记录 在培养液中加入5～10滴吲哚试剂，使试剂浮于培养物表面，形成两层，观察结果：如有吲哚存在，层呈现玫瑰红⊙色，此为吲＠哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“+”、阴性用“-”表示。
