Di 属于长链二烷基碳菁类染料，因其独特的结构★使其具有极强亲脂性，可与脂溶性生物结构结合，在一定浓度下，可以对细胞膜进行完全染色。Di 染料被激发后具有很高的淬灭系数和激发态寿命，在细▽胞与组织定位示踪中起到了极大作用。
常见 Di 染料
常见的 Di 染料包括 DiO、DiI、DiD、DiR，在被激发后形成不同颜色的荧光 (如图 1)。
图 1. DiO、DiI、DiD、DiR 光谱图
■ DiO 染色为例，简要抛出体外实验步骤
a）接种适量数目的细胞，37°C 培养过夜。
b）去除培养基，离心收集细胞，加入 PBS 洗涤 2-3 次，每次 5 分钟。
c）加『入对应浓度 DiO 工作液 (5-10 μM)，室温孵育 30 分钟。
d）400 g，4℃ 离心 3-4 分钟，弃去上清。再次加入 PBS 洗涤细胞 2-3 次，以充分去除未进入细】胞内的DiO。
f）用无血清培养基或 PBS 重悬细⊙胞后，在荧光显微镜或流式细胞仪下检测。
图 2. 实验流程简图
好了，接下来上ぷ实例！
■ DiO
DiO 为绿色荧光染料，激发/发︼射波长为 483/501 nM，DiO 常被用于正向或逆向示∏踪各类细胞或组织。(但相较其他三种染料，DiO 染料荧光强度较弱，对于某些固定的组织切片染色效果略差)。
Xin Li 等人研究了 CPCs (心脏祖细胞◥) 衍生的外泌体 (CPCs-Ex) 是否可∩以利用 mTOR 信号☆通路来减少病毒性心肌炎的细胞凋亡。研∩究人员用 DiO 对 CPCs-Ex 进行标记(Dio 可通过选择性分割被纳入细胞膜)，评估 H9C2 细胞对 CPCs-Ex 的体外摄取，荧光显微镜观察发现 H9C2 细胞的每个细胞质均包含荧光信号 (图 2)，并减少 H9C2 细胞的凋亡，确定了 CPCs-Ex 在 CVB3 感染细胞中的抗凋◣亡作用。
图 3. H9C2 细胞摄取 DiO 标记的外泌体[1]
■ DiI
DiI 为橙红色荧光染料，激发/发射∩波长为 551/569 nM，DiI 被用于正向或逆向示踪♀各类细胞或组织，荧光信号强≡度高于 DiO，在进入细胞膜时，其荧光信号会被大幅度放大。
如图 4 所示，Dil 染料标记外↘泌体，然后与目①标细胞共培养。使用共聚焦显微镜捕捉 HOS 细胞对 Dil 标记外泌体的摄取，其中被标记的外泌体发出特异性橙红色荧光。
图 4. HOS 和 MG63 细胞摄取红色荧光染料 Dil 标记的 hBMSC-Exos[2]
Dil 染料购自 MCE
■ DiD
DiD 为一种〇红色荧光染料，激发/发射波长为≡ 646/663 nM，DiD 荧光信号高、不易淬灭、自身荧光干扰低，不仅用于细胞/组织染色，小动物活体成像中是很常用的。
Yuxuan Fu 等人研究出一种药物传输方法来●达到抗新冠药物更好的△进入靶器官的目的，研究者使用 DiD 标记细胞●外小泡 (EV) 病毒蛋白的受体结合域 (EV-RBD) ，并进行小鼠尾静脉注射，通过荧光成像可以看到，信号主要在心脏、肺、肾脏●中聚集，并且值得注意的是，在 96 h 时，标记的 EV-RBD 累积的荧光信号仍保留在肺组织ξ中，这证明了●该方法的可行性。
图 5. DiD 标记 EV-RBD 在小鼠体内分布情况亡[3]
DiD 染料购自 MCE
■ DiR
DiR 是一种近红外染料，激发/发射波长为 754/778 nm，用于正向或逆向示踪各类细胞或组织，与 DiD 一样，DiR 自身＠荧光背景较低，也被用在活体成像中。
今天的介绍暂时就¤到这里了，小伙伴们看完是否有小小收获？
■ 产品汇总
Product Name | λex/λem | Description |
495/667 | DiA 亲脂性 Amino styrene group 探针，具有宽发射光谱 (可用绿色、橙色甚至红色滤光片检测)。常用于神经元膜追踪 (比 DiO 扩散得更♀快)。 | |
483/501 | DiO 是一种细胞膜绿『色荧光探针。在进入细◤胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激ξ 发出很强︼的荧光。 | |
646/663 | DiD Perchlorate 是一种远红色荧光亲脂性花青染料。DiD Perchlorate 能快速稳定地与磷脂细胞膜结合，能用于细胞追踪。 | |
549/565 | DiI (DiIC18(3)) 是一↘种亲脂性膜染料。DiI 在进入细胞膜之前荧光非◥常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。 |
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参考文献
1. Lei Zhong, Yueshan Li, Shengyong Yang, et al. Small molecules in targeted cancer therapy: advances, challenges, and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 31;6(1):201.
2. Xin Li , et al. Exosomes derived from carDiac progenitor cells attenuate CVB3-induced apoptosis via abrogating the proliferation of CVB3 and modulating the mTOR signaling pathways.Cell Death Dis. 2019 Sep 18;10(10):691.
3. Yao Huang , et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells promote osteosarcoma development by activating oncogenic autophagy. J Bone Oncol
